293A细胞（人胚胎肾细胞系）

293A细胞来源于人胚胎肾脏纤维母细胞，293A细胞是从293细胞系列中分离出的一个亚克隆，具有相对扁平的形态和良好的贴壁能力而得名（A代表adhesion）。293A细胞含有一个稳定整合的E1基因拷贝，能够提供生成重组腺病毒所需的E1蛋白（包括E1a和E1b），常用于腺病毒的初始生产、扩增和滴定。

在培养过程中，293A细胞呈现单层的扁平形态，没有明显的细胞重叠和细胞空隙（hole），这使得病毒滴定和空斑测定（plaque assay）更为容易。293A细胞的平坦形态使得滴定程序更简单，且细胞贴壁松散，操作时需轻柔处理。

293A细胞表达腺病毒E1区编码的基因，在反式激活某些病毒启动子中发挥关键作用，能够产生异常高水平的蛋白质，并补充E1缺失的重组腺病毒载体，促进病毒在研究应用中的复制。

293A细胞可表达异常的玻连蛋白的细胞表面受体，由整合素β1亚单位和玻连蛋白受体α-v亚单位组成。

293A人胚胎肾细胞特性

• 293A细胞来源于人胚胎肾脏纤维母细胞。

• 293A细胞是293细胞系列的一个亚克隆。

• 形态相对平坦，具有良好的贴壁能力。

• 含有稳定整合的E1基因拷贝，提供E1a和E1b蛋白。

• 常用于腺病毒的初始生产、扩增和滴定。

• 单层扁平形态，无明显的细胞重叠和细胞空隙。

• 有助于病毒滴定和空斑测定（plaque assay）。

• 可表达异常的玻连蛋白的细胞表面受体，由整合素β1亚单位和玻连蛋白受体α-v亚单位组成。

293A细胞参数表

293A人胚胎肾细胞系培养

细胞复苏步骤

• 将含有1ml 293A细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻。

• 移入事先准备好的含有4ml培养基的15ml离心管中混合均匀。

• 在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1ml培养基后吹匀。

• 将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查293A细胞密度。

传代步骤

1. 当293A细胞密度达80%-90%时，可进行传代培养。

2. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

3. 加2ml消化液（0.25% Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况。若293A细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入少量培养基终止消化。

4. 按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻吹打均匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

5. 收到293A细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1:2的比例分到新的含6ml培养基的培养皿或瓶中。建议冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:4的比例进行。

细胞冻存步骤

1. 待293A细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

2. 弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化。可使用血球计数板计数。

3. 在1000RPM离心5分钟去掉上清，用血清重悬，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中。每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

4. 将冻存管置于程序降温盒中，放入-80℃冰箱，至少2小时后转入液氮罐储存。记录冻存管位置以便下次取用。

培养过程中注意事项

• 传代时机: 当293A细胞密度达80%-90%汇合时进行传代。建议传代比例为1:3到1:5。

• 贴壁细胞: 293A细胞贴壁松散，操作时需轻柔。换液时需预热培养基。收货时如有大块脱落的细胞团为正常现象。

• 生长适应性: 293A细胞生长明显适应酸性环境，pH值在6.9～7.1时可顺利贴壁生长。换液时动作要轻，使用高糖的DMEM培养基。

• 观察频率: 复苏接种后24小时内，应尽量减少观察细胞次数或不作观察，以免因晃动而影响293A细胞贴壁。复苏后48小时左右观察贴壁情况并进行首次更换培养基比较合适。

• 转染建议: 建议使用10代内的293A细胞进行转染。使用磷酸钙转染时，当293A细胞生长到1/2或2/3时进行转染，可避免细胞大量脱落。

处理细节

• 细胞脱落处理: 收到293A细胞后放培养箱静止2-4小时，观察细胞是否再次恢复贴壁。如果贴壁，可去除培养基，轻柔PBS洗一次后加入Trypsin消化30-60秒，加入DMEM完全培养基终止消化，吹打4-6次至细胞全成单个悬浮细胞。

• 促进贴壁: 必要时可使用多聚赖氨酸、纤连蛋白进行包被，促进293A细胞的延展和贴壁。

转染小技巧

• 建议使用10代内的293A细胞进行转染。

• 磷酸钙转染时，避免细胞过度生长，最佳状态为293A细胞生长到1/2或2/3时进行转染。

• 慢病毒感染后，建议收取两次病毒液。48小时建议用正常血清浓度培养收毒，72小时建议使用低浓度血清进行培养，这样收的毒液滴度会大大增加。

• 使用大瓶培养比小瓶更有利于293A细胞均匀分布和营养摄取，促进病毒颗粒释放。