MLE-12细胞系（小鼠肺上皮细胞系）

MLE-12细胞系（小鼠肺上皮细胞系）是具有肺泡Ⅱ型上皮细胞相关表型的永生化小鼠肺上皮细胞系，由 Kathryn A. Wikenheiser 等于1992年建立。MLE-12细胞系来源于一只5月龄、雌性、FVB/N遗传背景的转基因小鼠肺部肿瘤，携带由人表面活性蛋白C（SP-C）基因启动子调控的SV40大T抗原转基因。MLE-12呈典型上皮细胞样形态，具有贴壁生长特性，能够持续传代。ATCC保藏编号为CRL-2110，Cellosaurus登记编号为CVCL_3751（RRID）。

MLE-12细胞具有一定的肺泡Ⅱ型上皮细胞生物学特征，可检测到肺表面活性蛋白B（SP-B）和肺表面活性蛋白C（SP-C）的表达，保留部分肺表面活性物质相关功能，包括特定条件下的磷脂分泌能力。MLE-12细胞系能够表达SV40大T抗原相关mRNA，其永生化与细胞转化特征主要来源于SV40大T抗原介导的细胞调控机制。由于MLE-12取材于转基因小鼠肺部肿瘤，而非正常肺组织中直接分离的原代细胞，因此不能将其视为未经转化的正常肺泡Ⅱ型上皮细胞。

MLE-12细胞常用于肺泡上皮生物学、肺表面活性物质合成与分泌、肺上皮损伤修复、炎症反应及肺部疾病相关机制等体外研究。MLE-12细胞虽然具有部分肺泡Ⅱ型上皮细胞特征，但其肿瘤来源及SV40大T抗原转化背景可能影响细胞的增殖调控和生理功能。

MLE-12细胞系特性特征

• 细胞类型：MLE-12 为转化的小鼠肺上皮细胞系，具有部分肺泡Ⅱ型上皮细胞相关特征，不等同于正常原代肺泡Ⅱ型细胞。

• 形态与生长：呈上皮细胞样形态，贴壁生长，可持续传代培养。

• 遗传背景：来源于 FVB/N 背景的转基因小鼠，品系登记为 FVB/N-Tg(SFTPC-TAg)5.1Jaw。

• 转基因特征：携带由人表面活性蛋白 C（SP-C）基因启动子区域调控的 SV40 大 T 抗原相关转基因。

• 表面活性蛋白表达：可检测到 SP-B、SP-C，是其具有肺泡Ⅱ型上皮相关表型的重要依据。

• 大 T 抗原表达：已记录表达 SV40 大 T 抗原 mRNA。

• 磷脂分泌：佛波酯和 ATP 刺激可诱导磷脂分泌；对毛喉素（forskolin）未观察到相应的磷脂分泌反应。

• 增殖特征：参考群体倍增时间约为 7～9 小时，对应原始记录中的第 12 代细胞。

• 致瘤性：可在裸鼠体内于 6～9 个月内形成肿瘤，体现其转化细胞特性。

• 其他标志物：ABCA3、NKX2-1/TTF-1、EPCAM、E-cadherin、ZO-1 等不宜未经验证便列为固定阳性或高表达标志，应结合具体研究或本批细胞检测结果。

• 超微结构证据：原始论文在部分 MLE 系列细胞中观察到微绒毛、多泡体和多层板状包涵体

MLE-12细胞系（小鼠肺上皮细胞系）参数表

MLE-12细胞系（小鼠肺上皮细胞系）培养教程

MLE-12细胞复苏

• 从液氮气相中取出MLE-12细胞冻存管，检查冻存管是否存在破损或密封异常。

• 将冻存管迅速放入37℃水浴中，轻轻晃动，使MLE-12细胞快速融化，通常约需2分钟。

• 待冻存液中仅剩少量冰晶时，立即取出冻存管。

• 使用70%乙醇充分消毒冻存管外壁，随后转移至生物安全柜内进行无菌操作。

• 去除冻存保护剂

• 将解冻后的MLE-12细胞悬液转移至无菌离心管中。

• 采用约125 ×g离心5～10分钟，使细胞沉淀。

• 小心吸除上清液，避免损失MLE-12细胞沉淀。

• 加入适量预温的完全培养基，轻柔吹打，使细胞重新分散。

• MLE-12细胞复苏时建议及时去除冻存保护剂，不建议将含DMSO的冻存液直接加入培养瓶后长期培养。

• MLE-12细胞接种培养

• 将重悬后的MLE-12细胞悬液接种至预先准备好的培养瓶中，轻轻晃动培养瓶，使细胞均匀分布，随后放入37℃、5% CO₂培养箱中培养。

• 复苏后应及时观察MLE-12细胞的贴壁情况、形态及培养液颜色变化。待细胞逐渐恢复正常生长状态后，推荐MLE-12细胞常规换液频率为每周2次，首次换液时间可结合细胞复苏后的恢复情况确定。

MLE-12细胞传代

• 去除MLE-12细胞旧培养液

• 在倒置显微镜下观察MLE-12细胞生长情况，确认细胞状态适合传代后，吸除培养瓶内的旧培养液。

• 随后加入少量Trypsin-EDTA消化液，短暂漂洗细胞表面，去除残留培养液及可能影响胰酶活性的血清成分，之后将漂洗液吸除。

• MLE-12细胞胰酶消化

• 向T75培养瓶中加入2～3 mL Trypsin-EDTA消化液，使其充分覆盖MLE-12细胞层。

• 观察细胞脱落情况，通常消化约5～15分钟。

• 如MLE-12细胞脱落较慢，可将培养瓶置于37℃环境中辅助消化。

• 待细胞逐渐收缩、细胞间连接减弱并开始脱落时，及时结束消化。

• 消化时间应根据MLE-12细胞实际状态灵活调整，不宜机械地等待固定时间，也不建议通过剧烈拍打培养瓶促使细胞脱落，以免增加细胞损伤和团聚。

• 终止消化与细胞分散

• 向培养瓶中加入6～8 mL完全培养基，终止MLE-12细胞的胰酶消化。使用移液器轻柔吹打，使细胞从培养瓶底部脱落并形成相对均匀的细胞悬液。

• 根据实验需要，可取少量MLE-12细胞悬液进行计数，记录细胞数量及活率。推荐的MLE-12细胞常规传代流程不要求每次传代必须进行离心处理，可在终止消化后直接进行分瓶接种。

• MLE-12细胞分瓶培养

• 将MLE-12细胞悬液按照1:5～1:10的比例分配至新的培养器皿中，补充适量完全培养基，使细胞能够均匀分布。

• 随后将培养瓶放入37℃、5% CO₂培养箱中继续培养。传代后记录MLE-12细胞代次、传代日期及传代比例，并定期观察细胞生长状态。

MLE-12细胞冻存

• MLE-12细胞专用说明书推荐冻存液中DMSO终浓度为5%，不建议直接采用其他细胞系常见的10% DMSO冻存配方。

• 按照前述MLE-12细胞传代步骤进行消化。

• 加入完全培养基终止消化，并轻柔吹打，使细胞充分脱落。

• 取样进行细胞计数，确定活细胞数量。

• 采用约125 ×g离心10分钟，收集MLE-12细胞沉淀。

• 小心弃去上清液，保留细胞沉淀。

• MLE-12细胞重悬与分装

• 根据活细胞数量计算所需冻存液体积，使用预先配制的完全培养基＋5% DMSO冻存液轻柔重悬MLE-12细胞，使最终细胞密度达到约1×10⁶～5×10⁶个活细胞/mL。

• 将细胞悬液分装至无菌冻存管中，常用分装体积为每管约1 mL，同时确保不超过冻存管规定的最大装量。冻存管外应清晰标注MLE-12细胞名称、代次、冻存日期及细胞浓度等信息。

• MLE-12细胞程序降温

• 细胞分装完成后，应尽快进行受控降温，避免冻存悬液长时间处于室温环境。

• 可采用以下两种方式：

• **程序降温仪：**设置约-1℃/分钟的降温速度，按照设备程序完成降温。

• **程序降温盒：**使用经过验证的被动式程序降温设备，按照设备说明书操作，在-70℃或更低温度的机械冰箱中完成初步降温。

• 采用通用被动降温流程时，通常至少保存24小时后再转入长期低温环境。

• MLE-12细胞长期保存

• 程序降温完成后，应及时将MLE-12细胞冻存管转移至低于-130℃的长期保存环境，优先采用液氮气相保存。

• MLE-12细胞不建议长期保存在-70℃或-80℃机械冰箱中。此类设备可用于冻存初期的程序降温，但不能替代长期低温保存。