永生化支气管上皮细胞

由于正常和患病原代支气管上皮细胞对数量有限、供体之间存在显著差异以及其有限的增殖能力，正常和患病原代支气管上皮细胞培养物的使用受到限制。此外可用的细胞系已使用病毒基因转化或源自肿瘤，不保持亲本细胞的形态和表型。永生化支气管上皮细胞寿命相对原代支气管上皮细胞较长，核型稳定，表型与原代亲本细胞相似。

人气道上皮细胞系 NuLi-1是由正常肺上皮细胞通过 HPV-16 E6/E7-LXSN 和 hTERT-LXSN 双重逆转录病毒感染而获得。人气道上皮细胞系 CuFi-1 ( 、CuFi-4 、CuFi-5 和 CuFi-6是由囊性纤维化患者肺上皮细胞通过 HPV-16 E6/E7-LXSN 和 hTERT-LXSN 或 pBabe-hygro-hTERT 双重逆转录病毒感染而获得。

细胞培养方案

用单克隆泛细胞角蛋白抗体（绿色）和 Hoechst 染料（蓝色）染色, 用单克隆泛细胞角蛋白抗体（绿色）和 Hoechst 染料（蓝色）染色

所需材料

支气管上皮生长培养基 (BEGM)，无血清（Lonza BEGM BulletKit、 CC-3170）

G-418

人胎盘胶原蛋白 IV 型，（Sigma，C-7521）

胰蛋白酶-EDTA 溶液（0.25% 胰蛋白酶/0.53 mM EDTA 溶于 HBSS）

经细胞培养测试的 DMSO 

胎牛血清 

杜氏磷酸盐缓冲盐水 

完全生长培养基的制备

这些细胞系的基础培养基是 BEBM。要制作完全生长培养基 (BEGM)，请将以下成分添加到基础培养基中：

SingleQuot 添加剂（随 BEGM BulletKit 提供）

50 微克/毫升 G-418

注意：

不使用 BEGM 试剂盒附带的庆大霉素-两性霉素 B。

冷冻细胞处理程序和培养启动

为确保最高水平的活力，收到后应尽快解冻小瓶并开始培养。如果到达后需要储存冷冻培养物，请将小瓶储存在液氮蒸汽相中，而不是-70°C 下。储存在 -70°C 下会导致活力丧失。

培养瓶应至少提前 18 小时用 60 µg/mL 人胎盘胶原蛋白 IV 型溶液预涂，然后风干并用杜氏磷酸盐缓冲盐水冲洗 2 至 3 次。

准备一个装有推荐的完全培养基的培养瓶。在加入培养瓶内容物之前，应将装有生长培养基的容器放入培养箱中至少 15 分钟，以使培养基达到正常 pH 值（7.0 至 7.6），并避免在细胞恢复过程中培养基碱性过高。

将小瓶放入 37°C 水浴中轻轻搅拌以解冻。为降低污染的可能性，请勿将 O 形圈和瓶盖放入水中。解冻应快速进行（约 2 分钟）。

解冻后立即将小瓶从水浴中取出，浸入或喷洒 70% 乙醇进行消毒。此后的所有操作都应在严格的无菌条件下进行。

将小瓶内容物转移到含有 9.0 mL 完全培养基的离心管中，并以约 125 xg 的速度离心细胞悬浮液 5 至 7 分钟。

弃去上清液，用新鲜的生长培养基重悬细胞（请参阅批次特定信息以了解推荐的稀释比例）。将此悬浮液加入准备好的培养容器中。

将培养物放入 37°C、5% CO 2、加湿的培养箱中孵育。

传代培养程序

给出的体积适用于 75 cm2培养瓶。对于其他尺寸的培养瓶，应按比例增加或减少所需的解离培养基量。

注意：

培养瓶应至少提前 18 小时用 60 µg/mL 人胎盘胶原蛋白 IV 型溶液预涂，然后风干并用杜氏磷酸盐缓冲盐水冲洗 2 至 3 次。

每 2 至 3 天更新一次培养基（不要超过 3 天），以维持培养中的细胞。

请参阅产品信息表，了解细胞应在何种浓度下进行传代培养。当确定细胞已准备好进行传代培养时，请继续下一步。

取出并丢弃介质。

向烧瓶中加入2.0至3.0 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，在倒置显微镜下观察细胞，直至细胞层分散（通常在5至10分钟内）。

为了去除胰蛋白酶-EDTA 溶液，在杜氏磷酸盐缓冲盐水中加入 2.0 至 3.0 mL 1% FBS，然后轻轻吹吸细胞。

将细胞悬浮液转移到 15 mL 离心管中，以约 125 xg 旋转 5 至 10 分钟。

弃去上清液，用新鲜生长培养基重悬细胞。将适当份量的细胞悬浮液加入新的培养容器中。请参阅产品说明书，了解推荐的接种浓度。

将培养物放入 37°C、5% CO 2、加湿的培养箱中孵育。

注意：

为避免细胞结块，在等待细胞分离时，请勿通过敲击或摇动烧瓶来搅动细胞。将烧瓶置于 37°C 下以促进细胞分散。

冷冻保存介质

在以下培养基中冷冻细胞：添加 10% DMSO 和 30% 胎牛血清的 BEGM。将小瓶储存在液氮蒸汽中。避免将小瓶浸入液氮中。