HLF细胞（永生化人肺成纤维细胞）

永生化人肺成纤维细胞（Human Lung Fibroblasts, HLF细胞）是源自人肺组织的间充质来源细胞，经过基因工程改造后获得无限增殖潜能。

HLF细胞最初通过从健康供体或手术切除的正常肺组织中分离获得原代肺成纤维细胞，借助慢病毒介导的SV40大T抗原导入技术进行永生化处理，筛选得到可稳定传代的细胞株，解决了原代细胞生命周期有限的技术瓶颈。

HLF细胞形态以长梭状或星状为主，呈贴壁生长特性，细胞核为椭圆形，核仁清晰，具有明显的合成代谢活性。其胞质轻度嗜碱性，内含丰富的内质网和高尔基体，支持其大量合成胶原、弹性蛋白及蛋白多糖等细胞外基质成分。

HLF细胞可通过差速贴壁、胶原酶和胰酶联合消化等方法从组织中分离纯化。永生化后的HLF细胞不仅具有原代成纤维细胞的基本生物学特征，还具备较高的增殖活性和遗传稳定性，适合进行高通量筛选和长期功能性实验操作。

在生理条件下，HLF肺成纤维细胞承担维持肺结构、支持基质稳定与正常修复功能的角色。而在病理状态下，如特发性肺纤维化（IPF）或慢性肺损伤过程中，HLF细胞可能经历表型转变与异常活化，产生大量胶原沉积，进而引发组织僵硬和肺功能障碍。

HLF细胞常被用于肺癌微环境模拟、转染实验、细胞行为分析以及外源基因表达等研究场景。得益于其稳定的生物学特性，HLF细胞在构建体外肺疾病模型方面具备显著优势，是研究肺组织纤维化机制、修复过程及相关治疗靶点的重要工具。

HLF永生化人肺成纤维细胞特性特征

• HLF细胞形态典型为纺锤形或星形，细胞轮廓清晰，贴壁生长，细胞质透明且嗜弱碱性。

• HLF细胞核呈规则的卵圆形，核仁明显且较大。

• HLF细胞排列紧密，有时交叉重叠，胞体较大，呈扁平状分布。

• 作为肺间质的主要细胞，负责合成和维持肺组织的细胞外基质，特别是III型胶原、弹性蛋白和蛋白多糖等关键成分。

• 在组织损伤发生时，肺成纤维细胞能大量聚集并参与修复过程，表现出旺盛的蛋白质合成和分泌活性。

• 免疫标志物：对间充质细胞标志物Vimentin和纤维连接蛋白（Fibronectin）呈阳性反应。

• 在某些条件下表达α平滑肌肌动蛋白（α-SMA），这与其在组织修复和纤维化中的作用相关。

• 高表达与胶原合成和细胞外基质重塑相关的基因，如COL1A1、COL3A1等，这些基因在组织修复和重建过程中发挥重要作用。

• HLF细胞质嗜弱碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动。

• 通过慢病毒转染携带SV40T抗原基因实现永生化，保证细胞持续分裂和稳定传代。

• 在病理状态（如肺纤维化）下，肺成纤维细胞表现出异常增殖和过度合成胶原蛋白，导致细胞外基质过度沉积和组织结构改变

HLF细胞参数表

HLF永生化人肺成纤维细胞培养教程

HLF细胞的复苏

• 从液氮罐中取出冻存的HLF细胞，迅速置于37℃水浴中解冻，摇匀约1分钟，直至细胞冰块完全融化。

• 将细胞悬液转入无菌离心管，加入4-5 mL预热的完全培养基（含10% FBS和1%双抗），轻轻混匀。

• 1000 rpm离心3-5分钟，弃去上清液，避免DMSO残留影响HLF细胞活性。

• 用1-2 mL完全培养基重悬沉淀，将细胞均匀接种于T25培养瓶。

• 培养瓶置于37℃、5% CO₂培养箱，24小时后更换培养基，去除未贴壁的死亡HLF细胞。

• 观察贴壁情况，健康的HLF细胞应在6-12小时内开始贴壁，24小时贴壁完整。

HLF细胞的传代

• 当HLF细胞融合度达80%-90%时，开始传代。

• 弃去培养基，用无钙镁PBS缓冲液洗涤1-2次。

• 加入0.25%胰酶-EDTA消化液（1 mL），置于37℃消化1-3分钟。

• 显微镜下观察HLF细胞变圆脱落后，轻敲瓶壁，加入等量完全培养基终止消化。

• 将细胞悬液转入离心管，1000 rpm离心4分钟，弃去上清液。

• 以适量完全培养基重悬HLF细胞，按1:2或1:3比例接种至新瓶。

• 传代过程中避免剧烈吹打，防止损伤HLF细胞膜结构。

• 24小时后更换新鲜培养基，确保HLF细胞适应新环境。

HLF细胞的冻存

• 选择处于对数生长期且形态健康的HLF细胞。

• 洗涤一次PBS，消化后收集细胞，1000 rpm离心4分钟，弃上清。

• 使用预冷的冻存液（90% FBS+10% DMSO）重悬HLF细胞，密度控制在5×10⁶~1×10⁷ cells/mL。

• 分装于冻存管，每管1 mL，做好标签。

• 使用程序降温盒缓慢降温，先置-80℃冰箱24小时后转入液氮长期保存。

• 推荐冻存后复苏一管HLF细胞以检测冻存活性。

HLF细胞培养的注意事项

• 所有操作应在无菌条件下进行，防止HLF细胞培养污染。

• 胰酶消化时间应适中，过长可能损伤HLF细胞；过短则消化不充分。

• 传代比例建议保持稳定，以维持HLF细胞生长状态一致性。

• 冻存液建议现配现用，确保DMSO浓度准确，防止影响HLF细胞冻存活性。

• 每次操作后观察HLF细胞形态和贴壁情况，及时调整培养策略。