Barrett永生化食管上皮细胞

原代Barrett食管上皮细胞在培养中的寿命有限，并且通常不含有可导致Barrett食管癌变的基因异常，这大大限制了它们作为该疾病进展模型的使用。相比之下， 永生化Barrett食管上皮细胞含有稳定、明确的细胞周期和基因异常，寿命较长，并且在核型、形态和表型上与原代亲本细胞相似。
Barrett 食管细胞系来源于从非发育不良化生区域获得的内窥镜活检标本，并用逆转录病毒表达载体 pLXSN-hTERT 转导。

细胞培养方案

用单克隆泛细胞角蛋白抗体（绿色）和 Hoechst 染料（蓝色）染色, 用单克隆泛细胞角蛋白抗体（绿色）和 Hoechst 染料（蓝色）染色

所需材料

• MCDB-153 培养基（Sigma，M7403）

• 氢化可的松

• 重组人表皮生长因子

• 霍乱毒素

• 腺嘌呤

• 牛垂体提取物

• 胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠补充剂（Sigma，I1884）

• 谷氨酰胺

• 胎牛血清（ 30-2020） 

• 杜氏磷酸盐缓冲盐水 (  30-2200 ) 

• 胰蛋白酶-EDTA 溶液（0.25% 胰蛋白酶/0.53 mM EDTA 溶于 HBSS）（ 30-2101） 

• 经细胞培养测试的 DMSO (  4-X ) 

• RPMI-1640 培养基 (  30-2001 ) 

完全生长培养基的制备

这些细胞系的基础培养基是 MCDB-153。要制作完全生长培养基，请将以下成分添加到基础培养基中：

• 0.4 μg/mL 氢化可的松

• 20 ng/mL 重组人表皮生长因子

• 1 nM 霍乱毒素

• 20 毫克/升腺嘌呤

• 140 μg/mL 牛垂体提取物

• 0.1% 胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠补充剂

• 4 mM 谷氨酰胺

• 5%胎牛血清

冷冻细胞处理程序和培养启动

为确保最高水平的活力，收到后应尽快解冻小瓶并开始培养。如果到达后需要储存冷冻培养物，请将小瓶存放在液氮蒸汽中，而不是 -70°C 下。在 -70°C 下储存将导致活力丧失。

有关从每批原代Barrett上皮细胞中回收的活细胞总数，

准备一个装有推荐的完全培养基的培养瓶。在加入小瓶内容物之前，应将装有生长培养基的容器放入培养箱中至少 15 分钟，以使培养基达到正常 pH 值（7.0 至 7.6），并避免在细胞恢复期间培养基碱性过高。

• 将小瓶放入 37°C 水浴中轻轻搅拌以解冻。为降低污染的可能性，请勿将 O 形圈和瓶盖放入水中。解冻应快速进行（约 2 分钟）。

• 解冻后立即将小瓶从水浴中取出，浸入或喷洒 70% 乙醇进行消毒。从此时起，所有操作都应在严格的无菌条件下进行。

• 将小瓶内容物转移到含有 9.0 mL 完全培养基的离心管中，并以约 125 xg 的速度离心细胞悬浮液 5 至 7 分钟。

• 弃去上清液，用新鲜生长培养基重悬细胞（请参阅批次特定信息以了解推荐的稀释比例）。确定活细胞数量，并将适量悬浮液加入培养瓶中。

• 将培养物放入 37°C、5% CO 2、加湿的培养箱中孵育。

传代培养和培养物的维持

• 给出的体积适用于 75 cm2培养瓶。对于其他尺寸的培养瓶，应按比例增加或减少所需的解离培养基量。

• 注意：为避免细胞结块，在等待细胞分离时，请勿通过敲击或摇动烧瓶来搅动细胞。为促进细胞分散，请将烧瓶置于 37°C 下。

• 每 2 至 3 天更新一次培养基，以维持培养中的细胞。

冷冻保存介质

在以下培养基中冷冻细胞：RPMI-1640 培养基，添加 10% 胎牛血清和 10% DMSO。将小瓶储存在液氮蒸汽中。避免将小瓶浸入液氮中。