原代大鼠脐静脉平滑肌细胞

大鼠脐静脉平滑肌细胞一般从脐带组织中提取，是脐静脉中膜的主要细胞类型，在维持血管功能与机体正常生理过程中具有不可或缺的作用。

原代脐静脉平滑肌细胞理想来源为大鼠胚胎脐带中脐静脉中膜层，但由于种属差异，目前实验中大鼠平滑肌细胞更多采用胸腹主动脉样本，而人脐静脉样本则较为常见。细胞的基本特性包括典型的梭形外观、良好的贴壁生长及“峰-谷”式生长模式。

大鼠脐静脉平滑肌细胞模型广泛用于血管病理学研究，如动脉粥样硬化形成机制、血管成形术后再狭窄及高血压相关血管重构，同时也被用于抗血管钙化药物的筛选、血管舒张/收缩调控剂的测试以及细胞外基质代谢研究。在基础研究中对于揭示平滑肌表型转化、机械应力响应和血管发育等方面也具有重要意义。当前研究趋势倾向于采用人脐静脉模型以更贴近人类疾病特征，而大鼠主动脉模型因技术成熟和重复性高而依然广受欢迎。

原代大鼠脐静脉平滑肌细胞特性特征

• 细胞形态：呈梭形、不规则形、三角形或扇形，核卵圆形居中。
  

• 生长模式：贴壁生长，细胞密度低时交织成网状，密度高时排列为旋涡状或栅栏状。
  

• α-SMA表达：通过免疫荧光检测，α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）阳性表达，用于鉴定细胞纯度。
  

• 波形蛋白（vimentin）表达：阳性表达，进一步确认细胞的平滑肌特性。
  

• 细胞标志物：α-SMA和vimentin的表达是其主要标志物。
  

• 炎症相关分子：可能表达ICAM-1和VCAM-1，参与炎症反应。
  

• 基因稳定性：在传代过程中保持相对稳定的基因表达特征，但长期传代可能导致表型漂移。
  

• 表观遗传调控：可能涉及多种表观遗传机制调控其生长和分化。
  

• 生长速度：传代后细胞生长较快，4-6天即可汇合。
  

• 传代能力：通常可传代3-5代，第3-5代细胞纯度最佳。
  

• 应用领域：用于研究动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄等疾病机制；用于筛选抗血管钙化药物和血管舒张/收缩调控剂

原代大鼠脐静脉平滑肌细胞参数表

原代大鼠脐静脉平滑肌细胞培养教程

UVSMC细胞复苏

• 从液氮储存中取出冻存管，将UVSMC细胞冻存管立即置于37℃水浴中，轻摇使UVSMC细胞迅速解冻（≤2分钟），以避免细胞因冰晶损伤。
  

• 使用75%酒精对UVSMC细胞冻存管外壁进行消毒，随后转入二级生物安全柜内操作，确保脐静脉平滑肌细胞操作环境的无菌性。

• 将解冻后的UVSMC细胞悬液转移至含5 mL预热培养基的15 mL离心管中。
  

• 以300×g离心5分钟后弃去上清液，确保彻底去除含DMSO的保护液，从而保护UVSMC细胞的活性。

• 初始接种

• 重悬UVSMC细胞于含20% FBS的平滑肌专用培养基中，随后将UVSMC细胞接种于预先用0.01%鼠尾胶原Ⅰ包被的T25培养瓶，接种密度控制在约5×10⁴ cells/cm²。

• 在37℃、5% CO₂条件下静置24小时后首次换液，使UVSMC细胞逐步适应培养环境。

脐静脉平滑肌细胞传代

• 弃去旧培养基后，用预温HBSS清洗UVSMC细胞两次，确保血清成分对消化酶的抑制最小化。
  

• 添加0.25%胰酶-EDTA（含0.02% EDTA）覆盖脐静脉平滑肌细胞，作用30秒后吸除90%的消化液，为后续梯度消化创造条件。

• 根据细胞状态，UVSMC细胞原代消化时间控制在3–5分钟，传代细胞则约为2–3分钟；通过显微观察脐静脉平滑肌细胞间隙扩大情况判断消化程度。
  

• 轻拍培养瓶促使脐静脉平滑肌细胞脱落，加入等体积含10% FBS的培养基迅速终止消化反应。

• 将脐静脉平滑肌细胞以1000 rpm离心5分钟，弃去上清后重悬于含PDGF-BB（10 μg/L）的培养基中。
  

• 以1:2比例传代，接种密度建议控制在约8×10³ cells/cm²，同时在培养基中添加TGF-β1（2 ng/mL），以维持脐静脉平滑肌细胞的收缩表型。

脐静脉平滑肌细胞冻存

• 配制冻存液时，采用FBS 90%和DMSO 10%，确保在冻存过程中为UVSMC细胞提供充足的营养支持及渗透性保护。
  

• 选择处于对数生长期且融合度达到80–90%的脐静脉平滑肌细胞进行冻存。
  

• 将预冷至4℃的冻存管中分装UVSMC细胞悬液（浓度不低于1×10⁶ cells/mL），并按梯度降温流程操作：4℃保温30分钟 → -20℃保存2小时 → -80℃过夜 → 最终转入液氮中长期保存。建议使用程序降温盒（如 Mr. Frosty™）以确保脐静脉平滑肌细胞降温速率约-1℃/min。

脐静脉平滑肌细胞关键参数控制

• 复苏阶段：UVSMC细胞存活率应高于80%，可通过台盼蓝染色进行检测。

• 传代阶段：UVSMC细胞消化时间须严格控制在误差±30秒以内，通过显微观察脐静脉平滑肌细胞回缩情况予以确认。

• 冻存阶段：确保脐静脉平滑肌细胞在冻存过程中DMSO暴露时间低于10分钟，复苏后检测脐静脉平滑肌细胞存活率。

脐静脉平滑肌细胞注意事项与常见问题解决

• 无菌操作与污染防控：在UVSMC细胞复苏后首次换液时加入两性霉素B（1 μg/mL）预防真菌污染，并在传代前将培养基预平衡至37℃（温差≤2℃），以减少对脐静脉平滑肌细胞的不利温度应激。

• 细胞表型维持：自第三代起，建议在培养基中添加抗坏血酸（50 μg/mL），以促进基质合成并保持脐静脉平滑肌细胞的稳定表型；传代超过5代时，需重新通过α-SMA免疫荧光鉴定脐静脉平滑肌细胞的纯度。

• 贴壁延迟：适当提高胶原包被浓度至0.03%，以增强脐静脉平滑肌细胞的黏附信号。
  

• 消化过度：采用0.1%胶原酶Ⅱ型预消化5分钟，选择性处理脐静脉平滑肌细胞间基质，防止过度消化。

• 冻存后活性降低：在冻存液中添加0.2 M海藻糖，协同DMSO保护脐静脉平滑肌细胞，从而提升复苏后活性。