mef细胞（永生化小鼠胚胎成纤维细胞系）

MEF小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse Embryonic Fibroblasts，MEF细胞）是从怀孕约9天的小鼠胚胎（如615小鼠）中分离，去除脑、心脏等器官后建立培养。mef细胞可作为胚胎干细胞（ES cells）的饲养层，提供生长支持并维持 ES 细胞的未分化状态。在用作饲养层时，为防止MEF细胞自身增殖干扰 ES 细胞，应使用丝裂霉素 C 处理使其生长停止。一般建议用于 ES 细胞培养的mef细胞不超过传代 6 代，以保证其支持功能。

永生化mef细胞通常通过引入病毒蛋白（如 SV40 大 T 抗原）、人端粒酶（hTERT）或敲除抑癌基因（如 Tp53）获得，可实现无限传代，适用于长期或大规模实验。永生化策略包括病毒感染、质粒转染或 CRISPR/Cas9 基因编辑。许多永生化mef细胞来源于具有特定基因敲除或转基因的小鼠胚胎（如 p53 缺失、FAK 或 FN 缺失），在此基础上通过进一步操作获得长期可传代的细胞系。

mef细胞系特性特征

• mef细胞为典型间充质／成纤维细胞，强烈表达波形蛋白（vimentin），一般不表达上皮角蛋白（keratin）

• mef细胞在转录组上与其他成纤维细胞共享多种细胞外基质和黏附分子基因的高表达，如多种胶原（Col1a1/Col1a2）、纤维连接蛋白（Fn1）等。
  

• 纤维细胞极化：在炎症因子（TNFα）或 TGFβ1 刺激下，mef细胞可以向“促炎”或“促纤维化”表型偏移，对应特定的小基因签名（如炎症因子、纤维化标志基因上调），在基因表达上高度可塑。

• mef细胞p53、Rb 等抑癌通路被功能性抑制或缺失，细胞周期相关基因、DNA 复制和修复相关基因表达上调。

• 自发永生化与 SV40T 永生化的mef细胞区别：SV40T细胞在基因表达上与野生型存在明显差异，尤其是细胞周期阻滞和凋亡相关基因的改变；同时，由于 p53 被 SV40T 结合并抑制，其下游如自噬调控等通路也会受到影响。

• MEF细胞（包括永生化 MEF）在细胞骨架、ECM、应激响应、信号转导等基因家族上具有高表达背景，且在特定基因缺失或刺激条件下可见成百上千个差异表达基因。

• 不同解剖部位与发育阶段的mef细胞存在明显的亚群差异，包括生长因子、细胞外基质、应激及代谢相关基因的表达差异。

• mef细胞高表达 vimentin，并可通过调节 ECM 相关基因和黏附分子改变迁移行为。

• 通常 MEF细胞 不表达典型的多能性标志（如 Oct4、Nanog 等），但在特定转基因模型或条件下，少数亚群可出现某些干细胞相关基因的表达。

• 多向分化潜能：条件性 SV40T 永生化的 mef细胞 被证明在去除 T 抗原后仍可保留间充质干／祖细胞样的多向分化潜力（如成骨、成脂等）。

mef小鼠胚胎成纤维细胞系参数表

mef小鼠胚胎成纤维细胞系培养教程

MEF细胞复苏（适用于冻存管）

• 将完全培养基（高糖 DMEM + 10% FBS + 100 U/mL 青霉素/100 μg/mL 链霉素）预热至 37 ℃。

• 在培养箱中准备 T25 或 T75 培养瓶，加入 5–8 mL 预温培养基。

• 从液氮中取出 MEF细胞冻存管，立即置于 37 ℃ 水浴中快速解冻（1–2 分钟），冰晶刚消失即可取出。

• 用 75% 乙醇擦拭管身，移至超净工作台操作。

• 将 1 mL MEF细胞悬液缓慢加入 4–6 mL 预温培养基中混匀。

• 1000 rpm 离心 3–5 分钟，弃去含 DMSO 上清液，加入 1–2 mL 培养基轻轻重悬。

• 将重悬 MEF细胞加入培养瓶中，轻轻摇匀。

• 放入 37 ℃、5% CO₂ 培养箱静置贴壁 6–8 小时。

• 复苏 12–24 h 后观察，必要时可换液一次以改善细胞状态。

• 解冻和去除 DMSO 需尽快完成，避免 MEF细胞受毒性影响。

• 第一次复苏后建议先传代 1 次再用于实验或冻存种子。

MEF细胞传代（贴壁操作）

• 当 MEF细胞融合度 70–80%（不超过 90%）时进行传代。

• 用作 ES 饲养层时可在 70–90% 范围，但避免长期过度汇合。

• 弃去旧培养基，用无钙镁 PBS 洗涤 1–2 次。

• 避免强烈吹打，防止大片 MEF细胞提前脱落。

• 加 0.25% Trypsin‑EDTA 覆盖底部（T25 瓶 0.5–1 mL），轻摇混匀。

• 37 ℃ 下静置 1–3 分钟，显微镜下观察 MEF细胞变圆，轻敲瓶壁即可脱落。

• 加等体积完全培养基终止消化，轻轻吹打使细胞分散。

• 转入离心管，1000 rpm 离心 3–5 分钟，弃去上清。

• 用 1–2 mL 培养基重悬，可计数以确定接种密度。

• 常用传代比例 1:3–1:5，第一次传代可 1:2 保守操作。

• 将 MEF细胞均匀分布于新瓶中，补足培养基至 5–7 mL，置 37 ℃、5% CO₂ 培养箱培养。

• 避免过度消化，保护膜蛋白和贴壁能力。

• 原代 MEF细胞建议在 P3–P5 内使用，超过传代上限可能出现衰老或表型改变。

• 传代间隔依据生长速度调整，一般 2–3 天一次。

MEF细胞冻存（建立种子库）

• 选择生长状态良好、对数期、融合度 80–90%、无污染的 MEF细胞冻存。

• 新到细胞建议在扩增 1–3 代内建立种子库。

• 常用：90% FBS + 10% DMSO，现配现用，置 4 ℃ 短时备用。

• 可使用商用无血清冻存液，按说明书操作。

• 按传代步骤消化、终止，1000 rpm 离心 3–5 分钟，弃去上清。

• 用少量培养基或预冷冻存液轻轻重悬，调整浓度至 1–5×10⁶/mL。

• 若先用培养基重悬，可缓慢加入等体积 2× 冻存液或直接调至终浓度 10% DMSO。

• 轻轻混匀，避免剧烈摇晃造成 MEF细胞损伤。

• 每管 1 mL 细胞悬液，盖紧管盖并标注：MEF细胞名称、品系/基因型、传代数、浓度、日期、操作者。

• 放入程序降温盒或泡沫盒，−80 ℃ 冰箱降温约 −1 ℃/min，至少 8–12 h。

• 冷冻过夜后转入液氮罐长期保存。

• DMSO 毒性高，操作后迅速降温，避免对 MEF细胞造成损伤。

• 种子细胞分批复苏，降低一次性失败风险。

• 建议建立冻存记录表，便于批次追踪。