Bend.3细胞（小鼠脑微血管内皮细胞系）

bEnd.3细胞是一种源自BALB/c小鼠脑微血管内皮的转化细胞系，具有典型的内皮细胞特性。bEnd.3细胞通过转染表达多瘤病毒中T抗原的NTKmT逆转录病毒载体，获得了内皮细胞特征，其形态呈现内皮细胞样式，喜贴壁生长。通过观察von Willebrand因子的表达以及荧光标记的低密度脂蛋白（LDL）的摄取，可以验证其内皮细胞特性。

bEnd.3细胞表达多种内皮细胞特有的抗原，包括ICAM-1、VCAM-1和MAdCAM-1。bEnd.3细胞具有MAdCAM-1、Peyer’s Patch高内皮受体和E-选择素的基因表达，这些基因可以在细胞受到刺激时诱导表达。

细胞因子和脂多糖（LPS）可以刺激bEnd.3细胞，诱导其表达淋巴细胞的Peyer’s Patch高内皮受体、粘膜血管寻址蛋白（MAdCAM-1）和E-选择素。这种诱导作用受到肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1（IL-1）或LPS浓度和时间的影响。

MAdCAM-1在未刺激的早期代数bEnd.3细胞表面表达，但在传代超过30代后不再表达。而细胞内粘附分子1（ICAM-1）具有持续性表达特点，并可通过LPS、IL-1和TNF-α的处理来增加表达。血管细胞粘附分子1（VCAM-1）在早期传代时持续表达，但在传代超过30代后停止表达。肿瘤坏死因子α（TNF-α）可在bEnd.3细胞中诱导P-选择素的表达，且在传代超过30代后表达水平进一步增加。

Bend.3细胞转染及特性

• 经转染表达多瘤病毒中T抗原的NTKmT逆转录病毒载体。

• 表达血管性血友病因子和摄取荧光标记的LDL，证实其内皮细胞特性。

• 通过细胞因子和LPS诱导，可以表达MAdCAM-1和E选择素。

• 对TNF-α、IL-1和LPS的诱导是时间和浓度依赖的。

• 早期代数细胞表达MAdCAM-1和VCAM-1，但超过30代后不再表达。

• 细胞可以分泌ICAM-1，并在受到LPS、IL-1和TNF-α刺激时增加表达。

• P选择素在受TNF-α诱导时分泌，且在细胞经过30代后分泌量增加。

BEND3小鼠脑微血管内皮细胞参数表

培养体系和条件：

• 培养体系：DMEM+10% FBS+1% PS

• 培养条件：气相：空气（95%）+CO2（5%），温度：37℃

• 传代步骤：当细胞密度达到80%-90%时，可进行传代培养。传代比例一般为1:2到1:4。

• 冻存步骤：细胞冻存时，先进行消化并终止消化，然后离心收集细胞沉淀并加入含DMSO的冻存液，最后置于液氮中保存。

常见问题和处理方法：

细胞形态问题：bEnd.3细胞生长较慢，低密度时呈现不规则形态，而高密度时呈现规则纤维状。若在培养过程中发现细胞形态异常，可能是细胞密度过低。建议在细胞铺满瓶底时进行传代，以提高细胞密度。

细胞消化问题：

• 消化时间：随着培养时间的延长，bEnd.3细胞的消化时间会增加。建议在培养4天后传代，消化时间一般为3-5分钟；培养7天后传代，消化时间一般为5-10分钟。具体消化时间以显微镜下观察细胞状态为准。

• 难消化问题：如遇到消化困难，可采用分次消化的方式解决。操作方法如下：

1. 吸出原培养液，加入PBS润洗细胞。

2. 加入胰酶进行消化，消化3-5分钟后加入PBS使细胞悬浮。

3. 将细胞悬液转移到含血清的培养基中，并吹散细胞，使其呈单颗细胞的悬浮液。

4. 继续消化，直到细胞块中间全部收缩变圆。

5. 终止消化，收集细胞悬液并离心，然后加入新鲜培养基。

培养注意事项：

• 细胞密度：细胞生长具有密度依赖性，建议在细胞密度达到80%-90%时进行传代。

• 换液频率：避免频繁换液，每隔2-3天换液或半量换液一次。

• 细胞收集：注意收集漂浮细胞，但贴壁细胞密度过高时可以丢弃。

• 培养基条件：细胞对温度和pH敏感，换液前可常温复温培养基4小时以上，避免使用pH改变的培养基。

• 分次消化：如消化时间过长，可采用分次消化，切勿强行吹下细胞。

• 冻存：冻存时注意细胞密度不低于1x10^6/ml，冻存管需标识清晰，并储存于液氮中。