大鼠外周血来源内皮祖细胞（原代内皮祖细胞）

大鼠外周血来源的内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells, EPCs）是一类源自大鼠循环血液中单个核细胞（Mononuclear Cells, MNCs）的原代细胞，具有血管生成潜能和组织修复能力。通过密度梯度离心法从外周血中分离出MNCs，随后接种于经纤维连接蛋白（Fibronectin）或明胶包被的培养皿中，并在特定的内皮细胞诱导培养基（如EGM-2）中培养，可获得具有高纯度和生理活性的EPCs。

大鼠外周血来源的内皮祖细胞具备迁移性、增殖性及分化为成熟内皮细胞的潜力，但在早期阶段缺乏成熟内皮细胞的典型表型，不能独立形成管腔样结构。尽管相比骨髓来源EPCs，其数量略少且增殖能力有限，但在多种病理过程中，如缺血性心脑血管疾病、外周动脉病变、肿瘤新生血管形成及创伤修复等方面，均展现出显著的生物学活性和治疗潜力。EPCs广泛应用于血管生成机制的研究、药物筛选、肿瘤血管调控机制探讨及组织工程构建等前沿领域，是再生医学与细胞治疗研究的重要细胞模型之一。

大鼠外周血来源内皮祖细胞特性特征

• 细胞形态：初期呈圆形，培养3-5天后贴壁生长，逐渐形成纺锤形或梭形，呈铺路石样排列。晚期EPCs形态更接近成熟内皮细胞，能形成血管样小管结构。

• 增殖与迁移能力：具有较强的增殖和迁移能力，晚期EPCs增殖能力较早期EPCs强，外周血来源的EPCs增殖能力较骨髓来源的相对较弱。

• 功能：不能自行形成管腔样结构（早期EPCs），但能通过分泌血管生成因子促进新生血管形成；晚期EPCs能直接形成血管样结构，参与缺血组织的血管生成和血管损伤修复。

• 透射电镜观察发现外周血来源内皮祖细胞含有Weibel-Palade小体（W-P小体），这是成熟内皮细胞特有的细胞器

  
  

• 表面标志物：

• 表达内皮细胞特异性标志物：CD31、CD34、VE-cadherin、KDR（VEGFR-2）、von Willebrand因子（vWF）等。

• 早期EPCs可能表达CD45（造血细胞标志）较弱，晚期EPCs表达更接近成熟内皮细胞，CD31和vWF表达持续较高。

• 外周血来源的EPCs为晚期内皮祖细胞，CD31、vWF、Flk-1等成熟内皮标志物表达较高且持续。

  
  

• 功能性鉴定：

• 能吞噬DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白（DiI-Ac-LDL），呈红色荧光。

• 能结合FITC标记的荆豆凝集素（UEA-1），呈绿色荧光。

• 双阳性细胞被鉴定为内皮祖细胞。

  
  

• 基因表达：

• 晚期EPCs表达VE-cadherin、Flt-1、KDR、eNOS、vWF等内皮细胞相关基因，具有较强的一氧化氮（NO）生成能力。

• 早期EPCs基因表达较杂，逐渐丧失CD45、CD31表达，且VE-cadherin、KDR表达减弱。

大鼠外周血来源内皮祖细胞参数表

原代大鼠外周血来源内皮祖细胞培养教程

EPCS细胞复苏操作流程

• 将EPCS细胞冻存管自液氮罐中取出，迅速置于37℃水浴中解冻，轻轻摇晃约1~2分钟，直至内容物全部融化。

• 使用75%乙醇擦拭管外表面后，转入生物安全柜内进行无菌操作。

• 将细胞悬液缓慢滴入含4 mL预温完全培养基的15 mL离心管中，轻轻混匀以降低DMSO毒性。

• 以1000 rpm离心4分钟，去除上清。

• 加入12 mL完全培养基重悬EPCS细胞，并移入预包被0.1 mg/mL多聚赖氨酸（PLL）或0.1%明胶的T25培养瓶中，补足培养基至68 mL。

• 置于37℃、5% CO₂培养箱培养。次日更换培养基以去除未贴壁细胞。

• 注意：原代EPCS细胞贴壁较慢，复苏后24小时内不应频繁移动培养瓶，以防影响贴壁效率。

EPCS细胞传代流程

• 当EPCS细胞汇合度达80%-90%时进行传代（一般每3-4天传代一次）。

• 弃去培养基，使用无钙镁PBS洗涤2次。

• 加入1 mL 0.25%胰酶-EDTA，置于37℃下消化1~2分钟，轻敲瓶壁帮助细胞脱落。

• 加入2倍体积完全培养基终止反应，轻轻吹打混匀。

• 以1000 rpm离心4分钟，弃上清后重悬EPCS细胞。

• 按1:2至1:6比例接种至新瓶，补加8 mL新鲜完全培养基，继续培养。

• 建议每次传代前对EPCS细胞进行显微镜检查，确保细胞形态良好且无污染。

EPCS细胞冻存流程

• 选择处于对数生长期的EPCS细胞进行冻存操作。

• 弃去培养基后用PBS洗涤一次，消化收集细胞。

• 计数细胞浓度，调整至1×10⁶ ~ 2×10⁶ cells/mL。

• 配制冻存液：90%完全培养基 + 10% DMSO，或使用无血清冻存液。

• 按1 mL/管分装于冻存管中，标记清楚细胞编号与冻存日期。

• 将冻存管置入程序降温盒，-80℃预冻2小时后转移至液氮中长期保存。

• 为保护EPCS细胞活力，应尽量缩短细胞与DMSO接触时间，冻存过程务求迅速规范。

培养条件与注意事项

• 培养温度：37℃；气体条件：5% CO₂，95%空气。

• 培养基推荐使用EPCS细胞专用完全培养基，含有VEGF、bFGF等生长因子以维持其祖细胞状态。

• 全程需无菌操作，定期观察细胞状态。

• 对于贴壁性不佳或生长缓慢的EPCS细胞，可在包被基质中加入细胞外基质蛋白如fibronectin或collagen以提高粘附性。

• 定期检测支原体污染，保障EPCS细胞纯净性。