A375细胞（人恶性黑色素瘤细胞）

A-375人恶性黑色素瘤细胞系是从一位54岁女性患者的皮肤恶性黑色素瘤中分离，具有上皮样形态。A375细胞系最早由D.J. Giard等人在1975年建立，已广泛应用于肿瘤学研究和药物筛选。

A375细胞的染色体数为亚三倍体，具有62条染色体模数，每个细胞通常含有9条标记染色体，并且在N2、N6和N22染色体上各有一个拷贝。作为NRAS突变体A375的同源对照细胞系，A375细胞是研究毒理学和免疫肿瘤学的重要模型，特别适合作为转染实验的宿主细胞。

A375细胞特性特征

• 在免疫抑制的小鼠中，A375细胞能形成快速增长的皮下肿瘤，显示出其良好的致瘤性。

• A375细胞系还可以在普通成纤维细胞饲养层和琼脂上形成克隆。

• 基因突变：A-375细胞是NRAS突变体，常用于与NRAS突变相关的研究。

• 表达特征：A375细胞对多种药物敏感，如新狼毒素A能够以时间和剂量依赖的方式显著抑制其生长和增殖，导致细胞体积缩小、皱缩以及核质浓缩。

• 毒理学研究：A-375细胞被广泛用于毒理学研究，尤其是药物对黑色素瘤细胞的影响。

A375细胞参数表

A375人恶性黑色素瘤细胞培养教程

A375细胞复苏

• 准备培养基：将所需的完全培养基（例如88% DMEM（高糖） + 10%胎牛血清（FBS） + 1%青霉素/链霉素（P/S） + 1%谷氨酰胺）提前放入37℃培养箱中预热30分钟，以便复苏A375细胞时使用。
  

• 取出A375细胞：从液氮罐中取出冻存的A375细胞管，迅速放入37℃水浴中，轻轻摇动至细胞完全解冻（约1-2分钟）。

• 转移A375细胞：将解冻后的A375细胞悬液转移至含有5-10毫升预热培养基的离心管中，轻轻混匀。

• 离心：以1000 rpm离心5分钟，去除上清液，保留沉淀的A375细胞。

• 重悬A375细胞：用适量新鲜培养基重悬A375细胞，确保细胞充分混匀。

• 接种A375细胞：将重悬后的A375细胞接种至预先准备好的T25或T75培养瓶中。

• 培养条件：将培养瓶放入37℃的培养箱中，维持95%空气和5%二氧化碳的培养环境以促进A375细胞生长。

A375细胞传代

• 观察A375细胞状态：在显微镜下观察A375细胞，当细胞汇合度达到70%-80%时即可进行传代。
  

• 去除培养基：吸走旧培养基，轻轻用PBS洗涤A375细胞，去除死细胞和残留物。

• 消化A375细胞：加入适量0.25%胰酶-EDTA，轻轻摇动培养瓶，确保A375细胞均匀接触胰酶，通常消化3-5分钟。

• 停止消化：当A375细胞开始脱落时，立即加入新鲜培养基停止消化反应。

• 离心：将A375细胞转移至离心管中，1000 rpm离心5分钟，去除上清液。

• 重悬A375细胞：用新鲜培养基重悬A375细胞，并按1:2或1:3比例接种至新培养瓶中。

• 换液：每周2-3次更换培养基，以保持A375细胞生长环境的清洁。

A375细胞在琼脂中的克隆形成

• 准备琼脂培养基：将2倍浓度的DMEM基础培养基与等量的2%液体琼脂混合，制成1%琼脂培养基，以便用于A375细胞的克隆形成实验。
  

• 铺底层琼脂：将1%琼脂培养基分注至培养皿中，静置至凝固。

• 制备A375细胞悬液：将对数生长期的A375细胞消化成单细胞悬液，调整浓度至1×10^4-1×10^5 cells/ml。

• 加入顶层琼脂：将A375细胞悬液与等量的1%液体琼脂混匀，迅速加入底层琼脂上，静置至凝固。

• 加培养基：在琼脂表面小心加入培养基，避免破坏琼脂层。

• 培养：将培养皿置于37°C、5%CO2培养箱中，每3-4天更换培养基。

• 观察克隆形成：通常2-3周后，在显微镜下可见肉眼可见的A375细胞克隆。

A375细胞在成纤维细胞饲养层中的培养

• 准备饲养层：在培养皿中接种适量成纤维细胞，待其生长至100%汇合，以便接种A375细胞。
  

• 处理饲养层：用PBS洗涤成纤维细胞，然后用含10μg/ml米托蒽醌的PBS处理2小时进行灭活。

• 洗涤：用PBS洗涤饲养层3次以去除灭活液。

• 接种A375细胞：将对数生长期的A375细胞接种至饲养层上，细胞密度根据实验需要调整。

• 培养：在37°C、5%CO2培养箱中培养，2-3天更换一次培养基。

• 观察克隆形成：定期观察A375细胞在饲养层上形成的克隆。

注意事项

• 无菌操作：整个操作过程需严格保持无菌，防止A375细胞污染。

• 细胞状态监测：复苏和传代后24小时内应及时观察A375细胞状态，必要时更换培养基以去除死亡细胞。

• 细胞颗粒感：A375细胞在培养过程中可能会出现细胞内黑点和细胞外颗粒，建议使用优质胎牛血清和培养基。